抑制ELISA試劑盒實驗*新方法

一、封閉液、洗滌液及保護液的優化

1、封閉液的優化

采用文獻報道的方法進行封閉，其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。

2、 洗滌液的配制

采用文獻報道的方法配制洗滌液。

3、 酶標板保護液的優化

酶標板經過封閉后在低溫下僅能存放2周左右，為了延長固相酶標板上抗原的穩定性，我們增加了一步保護酶標板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無關蛋白質、慶大霉素以及二價金屬離子，作為酶標板保護劑，在封閉完后加入保護液于4℃冰箱中孵育過夜，同時與未做保護的酶標板進行對照，然后將保護的及未保護的酶標板置于37烘箱中放置15天，考察保護液對酶標板的穩定性的影響。

二、酶標抗體稀釋度的優化

抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標抗體做系列稀釋：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；經孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動酶標儀分析，選擇A值為1.5左右的酶標抗體稀釋度為*適工作濃度。

三、酶標抗體保護液的優化

低濃度的酶標抗體極容易受到高溫、微生物、以及蛋白酶的影響而失活，嚴重影響產品的貨架期，過去通常將酶標抗體凍干保存，然而這樣的保存，不僅由于在凍干的過程中會影響酶標抗體的活性，而且在臨床應用中頗為不便。適當的緩沖液以及添加無關蛋白質、糖、防腐劑以及一些含氨基的化合物等都會對對酶標抗體的活性起一定的保護作用，因此我們設計了一組保護劑用于保護酶標抗體，與未添加任何糖蛋白的酶標抗體做對照，將經保護的酶標抗體及未保護的酶標抗體置于37℃烘箱中放置6天，考察保護液對酶標抗體的影響。一、 抗體的酶標記及質量鑒定

本試驗采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶標記在抗體上[1]，標記完后取上清用Sephedex G200 凝膠層析進行純化，洗脫液為0.2mol/L pH7.4的PBS，流速為15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度計測A280吸光度值，以洗脫體積為橫坐標，吸光值為縱坐標做圖，ELISA試劑盒收集**峰即為酶標抗體峰。標記完后用紫外分光光度計在分別在280nm、及403nm處測定酶標記物的A值，計算**球蛋白量、摩爾比值、酶結合率以及標記率。

四、包被用緩沖液及*適包被抗原濃度的優化

1、包被緩沖液的優化

包被抗原時，為了得到*佳的包被效果，我們采用了碳酸鹽緩沖液（50mM ph9.6 ）、磷酸鹽緩沖液（50mM ph7.6）、以及TRIS鹽酸緩沖液（50 mM ph7.6）三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ug/ml，及2.5ug/ml,酶標抗體工作濃度為1：400及1：300，用自動酶標儀分析，選擇*佳的包被緩沖液系統。同時為了保證緩沖液能夠長期保存，我們在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作為防腐劑。

2、*適抗原包被濃度的優化

用優化好的包被緩沖液，將包被抗原（ALB）稀釋成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六個濃度，包被微孔板，每孔100ul；競爭抗原濃度為4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶標抗體稀釋度為1：300，經孵育、顯色、終止后用自動酶標儀分析。顯色的強度在一定范圍內與包被的抗原量成正比，但隨著包被抗原濃度的增加，顯色的強度反而降低，我們選擇臨界包被值作為包被抗原量。