那么如何能控制ELISPOT檢測的質量呢？如果有一種細胞和一種刺激物，并且ELISPOT斑點頻率是已知的話，那么就有了一個ELISPOT的標準系統。每次其它樣品檢測時，只要帶上這個系統，實驗者就可以用標準系統來質控待測樣品的ELISPOT檢測。這也是所有其它檢測質控的基本原理。

      現在的關鍵是找到這樣一種細胞和一種刺激物，每次都能做出完全相同的ELISPOT結果。

二、標準細胞必須采用凍存細胞庫

     首要問題是細胞。我們知道，細胞是有生命的，不像無生命的物質那樣容易保存。那么能不能采用新鮮細胞呢，比如每次都從同一個志愿者身上采集？不能。因為志愿者的健康狀態和**狀態都是動態的，雖說采自同一個人，但是細胞**水平可能會有變化，ELISPOT結果無法完全重復。那么能不能采集細胞之后長期飼養呢？不能。且不說長期培養成本高且周期長，細胞本身的**水平和克隆數目都會隨著培養和傳代而發生變化。

      能滿足ELISPOT檢測長期不變化的只能是凍存細胞庫。一次采集大量細胞凍存在-197°C的液氮環境中，細胞的斑點頻率可以在數年之內恒定不變。PBMC分離和凍存復蘇的方法參見本網站內容。

三、標準刺激物選用CEF或者ICE

     那么，刺激物選擇什么呢？非特異性的刺激物很便宜，但是不能用于質控。三個原因阻礙了這一點。

    其一、非特異性的刺激物刺激效果不穩定。如圖9.2所示，非特異性的刺激物（有絲分裂原Mitogen）的刺激曲線幾乎沒有平坦的部分。也就是說，刺激物的濃度有細微變化，馬上就會體現在刺激斑點數目的變化上了，這樣實驗結果很難完全重現。相反，抗原的刺激曲線非常平坦，只要達到有效刺激濃度，斑點頻率就不再變化。

     其二，非特異性刺激物的刺激原理與特異性的刺激物刺激原理不同。一般來說，質控系統和被質控的體系之間越相近越好：經過相同的處理，接受相同的影響因素，發生相同的物理、化學、生物過程。但是非特異性刺激物刺激是單細胞過程，與抗原經APC呈遞而刺激T細胞是完全不同的過程。所以用非特異性刺激反應質控與特異性刺激反應質控，從原理上也說不同。

     其三，非特異性刺激物多數是蛋白質，比如PHA與ConA，效價不穩定，容易失活，不易保存。相對而言，作為抗原的蛋白和多肽，**原性和刺激效果要穩定得多。

      綜上所述，在質控系統中，標準刺激物宜選用抗原。抗原中，以T細胞表位肽組成*簡單，機理*清楚，結果*穩定，所以是優選。再則考慮到標準刺激物對健康人的T細胞也應該能刺激作用，所以國際上選定三種常見病毒CMV、EBV、Flu Viurs，把它們的32條T細胞表位肽集中起來，作為ELISPOT標準樣性刺激物CEF。另有簡化版的23條肽肽庫ICE（貨號CT370），更加實用。 

 四、實驗室內部質控與實驗室之間的質控以及國家質控體系

      以上介紹了ELISPOT質控系統的原理與組成。現在來介紹一下質控系統的應用范圍。根據質控系統的應用范圍，可以分為以下三個層次。

     *基本的層次是實驗室內部質控系統。比如一個實驗室有好幾組實驗人員，會在很長的時間內（一年或數年）做高質量的ELISPOT檢測。這就需要用到實驗室內部的質控系統。因為實驗室內部的條件相對穩定，管理相對統一，實驗室內部質控系統的技術目前已經非常成熟。達科為公司有整套建立實驗室內部ELISPOT質控系統的方案，已經幫國內數家實驗室建立了這一系統。實踐也證明了該系統有效可行，指控效果非常明顯。

     **個層次是實驗室之間的質控系統。當今的科研有合縱連橫的趨勢，一些重大的科研項目或者疫苗的臨床評估往往是跨實驗室、跨地域甚至跨國家的聯合項目。為了使這些分布在不同地區不同時間的ELISPOT檢測有相同的標準和可信度，必須采用實驗室之間的質控系統。就我們達科為公司與國內十余家實驗室聯合作的評估而言，實驗室之間的質控存在**的一個非技術障礙，那就是凍存質控細胞的運輸問題。

     凍存細胞*好能通過液氮運輸，如果采用小型背負式液氮罐，實驗者可以在同一城市的不同實驗室之間運輸凍存細胞，但是對于跨城市或者跨國家的長途運輸就不太可能了。液氮罐上飛機或者火車都是非法的。如果采用干冰運輸，凍存細胞的狀態和存活率就會打折扣。我們的研究表明，經過干冰運輸的細胞，存活率只有80%左右。并且干冰運輸的可靠性也不能完全得到保證，一旦干冰耗盡或者細胞未完全**冰包裹，細胞的存活率就會直線下降，甚至完全死亡。

     第三個層次是國家質控系統。任何成熟的檢測技術都會有相應過國家標準和質控系統。但是由于ELISPOT技術還在發展中，目前世界上還沒有任何一個國家建立了ELISPOT技術的國家標準和質控系統。美國是該項工作開展得比較早的國家，目前仍然在不同實驗室之間作驗證工作，研究建立質控系統的可行性。

    如表9.1所示，這是我們一次實驗的結果。可以看到，前三個實驗室的結果重復性很好，但是第四個實驗室的結果明顯偏小。