斑點(diǎn)雜交方法——優(yōu)化抗原和抗體濃度

斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度

對于一個(gè)給定的抗原，*佳的抗體濃度依賴的抗原和抗體本身。抗原和抗體的親和力，以及一抗與二抗的特異反應(yīng)都是不同的。*優(yōu)抗原和抗體濃度可通過**印跡實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的抗原和抗體作用確定。另外，更快和更簡單的方法是進(jìn)行斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)。以下是使用超敏感信號底物進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡的操作方法。

斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度注：所有的抗體稀釋度假定起始濃度為1 mg/mL。

1. 用TBS和PBS稀釋的蛋白樣品，好的稀釋方法是由樣品中的抗原稀釋濃度決定的，但是由于抗原的濃度是未知的，所以有必要進(jìn)行寬范圍的稀釋度的檢測。SuperSignal West Pic化學(xué)發(fā)光底物的檢測靈敏度可達(dá)皮g水平，所以樣品的稀釋范圍可以從微克水平到皮克水平。如果要使用過多的抗原，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)以下情況：非特異性條帶、模糊條帶和信號降低。

2. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印膜。所需膜的數(shù)量依賴于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少種不同稀釋濃度。通常，一種或兩種一抗的稀釋度是用兩種或三種不同的二抗稀釋度進(jìn)行測定的。斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度例如：1/1000的一抗和1/50000的二抗；1/1000的一抗和1/100000的二抗；1/5000的一抗和1/50000的二抗；以及1/5000和1/100000的二抗。

3. 將膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點(diǎn)在膜上。用盡可能小量的稀釋液點(diǎn)在膜上（2-5 ul為宜），因?yàn)橛玫捏w積越大，信號越彌散。抗原溶液在膜上干10-30分鐘或直至無可見的水分。

4. 斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度用含0.05%的Tween-20封閉液封閉膜上的非特異性點(diǎn)，室溫震蕩孵育1 h。

5. 將一抗稀釋到封閉液/Tween-20去污劑中，并加到膜上，室溫震蕩孵育1h。

6. 用TBS或PBS洗膜4-6次，用盡可能大體積的洗脫液， 在洗脫液中加入0.05%的吐溫，用以減少非特異背景。每次洗脫過程中，使膜懸浮在洗脫液中震蕩大約5分鐘，倒出洗脫液并重復(fù)。孵育前，在洗脫液中短時(shí)間的漂洗可能會(huì)增加洗脫效率。

7. 斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度制備二抗/HRP結(jié)合的封閉試劑/Tween-20去垢劑稀釋液，將二抗稀釋液加到膜上震蕩孵育1 h。

8. 按第6步方法再次清洗膜。

9. 準(zhǔn)備底物工作緩沖液，混合等體積的魯米諾/增強(qiáng)劑和穩(wěn)定的過氧化物溶液。制備足夠體積確保印跡點(diǎn)完全濕潤，保證印跡點(diǎn)在孵育過程中不會(huì)干。推薦體積：0.1 ml/cm2印跡面。

10. 將膜在超感應(yīng)顯色底物工作液中孵育5分鐘；

11. 將膜從底物上移除，放到塑料布或其它防護(hù)膜上；

12. 將印跡貼到膠片上，在蛋白旁邊曝光。任何標(biāo)準(zhǔn)的或者增強(qiáng)的放射自顯影膠片都可以用。推薦**次曝光30-60 s，為得到*佳結(jié)果，曝光時(shí)間可不同。另外，也可用CCD相機(jī)或其它成像設(shè)施；然而這些設(shè)施可能需要更長的曝光時(shí)間。

13. 斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度在*佳的印跡膜上，超感應(yīng)反應(yīng)底物產(chǎn)生的信號可能會(huì)持續(xù)超過8 h。未獲得*佳結(jié)果，印跡能重復(fù)曝光到膠片上或者成像系統(tǒng)中。隨印跡時(shí)間的延長，需延長曝光時(shí)間。如果未得到*佳結(jié)果，可用抗原和/或抗體稀釋液重復(fù)進(jìn)行這個(gè)程序。